Позаконазол - наномицеллы с добавлением масла семян конопли

Позаконазол - наномицеллы с добавлением масла семян конопли для лечения инвазивных грибковых заболеваний

Posaconazole-hemp seed oil loaded nanomicelles for invasive fungal disease

Анджали Рати, Павитра Соланки, Наср А. Эмад, Iqra Zai, Саим Ахмад, Шадаб Алам, Али С. Алькахтани, Омар М. Номан, 

Канчан Кохли, Ясмин Султана 

том 14 научных отчетов, номер статьи: 16588 (2024)

 

Sci Rep 14, 16588 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-66074-1

 

АННОТАЦИЯ

Инвазивные грибковые инфекции (ИФИ) представляют значительную нагрузку на здоровье, приводя к высокой заболеваемости, смертности и стоимости лечения. Целью данного исследования является разработка и характеристика наномицелловых препаратов для совместного применения позаконазола и масла семян конопли при ИФИ пероральным путем. Наномицеллы были получены с использованием метода нанопреципитации и оптимизированы с помощью конструкции Box Behnken. 

 

Оптимизированные наномицеллы привели к удовлетворительным результатам исследований дзета-потенциала, размера, PDI, эффективности захвата, TEM и стабильности. Результаты FTIR и DSC подтверждают совместимость и аморфное состояние полученных наномицелл. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия показала, что оптимизированные наномицеллы проникали в ткань глубже (44,9 мкм), чем суспензия (25 мкм). Наномицеллы, содержащие лекарственное средство, демонстрировали устойчивое кумулятивное высвобождение лекарственного средства в размере 95,48 ± 3,27% в течение 24 часов. 

 

Наномицеллы показали значительное ингибирование в отношении Aspergillus niger и Candida albicans (22.4 ± 0,21 и 32,2 ± 0,46 мм соответственно). Фармакокинетическое исследование на крысах линии Вистар показало увеличение относительной биодоступности наномицелл по сравнению с суспензией в 1,8 раза. Эти результаты подтверждают их терапевтическую эффективность и закладывают основу для будущих исследований и клинического применения, обеспечивая многообещающий синергический подход к лечению МФИ с использованием наномицелловых препаратов.

 

С начала двадцать первого века грибковые заболевания резко расширились в нескольких средах. Инвазивные грибковые инфекции (ИИ) связаны со значительными рисками для здоровья в виде смертности и заболеваемости. Ежегодно примерно 1,9 миллиона человек сталкиваются с острыми инвазивными грибковыми инфекциями, и еще, по оценкам, 3 миллиона человек во всем мире страдают хроническими и тяжелыми грибковыми инфекциями1. 

 

На протяжении последних двух десятилетий трудности с лечением, вызванные IFI, прогрессировали2. Общий период терапии определяется фактическим прогрессом в лечении пациента, а также видом и степенью лежащей в основе иммуносупрессии3. Было замечено, что число пациентов с ослабленным иммунитетом, подверженных риску грибковых заболеваний, неуклонно растет с момента распространения ВИЧ / СПИДа, рака, операций по пересадке и других способствующих факторов4. Значительная распространенность грибковых инфекций наряду с растущими затратами подчеркнула потребность в более эффективных и малотоксичных препаратах для лечения5.

 

USFDA [Управление по контролю за продуктами питания и лекарствами США] одобрило противогрибковый препарат категории триазолов, известный как позаконазол6. Этот препарат широко используется для лечения кандидоза ротоглотки и пациентов с ослабленным иммунитетом, которым проводится трансплантация гемопоэтических стволовых клеток [ТГСК] или химиотерапия рака, поскольку у них есть риск заражения МФИ. Его также назначают в качестве профилактического и перспективного лекарственного средства при инфекциях, вызываемых Candida, Aspergillus или грибковыми нитями. 

 

Позаконазол относится ко второй категории по системе классификации биофармацевтических препаратов, обладая высокой проницаемостью и низкой растворимостью. Противогрибковое действие вполне сопоставимо с другими азольными препаратами той же категории, поскольку они преимущественно ингибируют CYP-зависимые 14-α деметилазы в пути биосинтеза эргостерола, который является жизненно важной частью клеточной мембраны гриба. Накопление опасного эргостерола и снижение уровня 14-α метилстеролов происходит из-за нарушения ферментативной активности, что приводит к нарушению функции клеточных мембран грибка и предотвращению деления и роста клеток. Период полувыведения (T1 / 2) составляет от двадцати до шестидесяти шести часов, средний T1 / 2 составляет тридцать пять часов, а полный вывод из организма осуществляется через тридцать два часа. Основным механизмом выведения является экскреция с калом (в основном родительских препаратов), при этом почечный клиренс составляет всего около 13% от общей пероральной дозы конъюгата7,8.

 

Cannabis sativa L. (масло семян конопли) имеет состав жирных кислот, присутствующих в растении, который обычно упоминается, наряду с включением линолевой кислоты, которая повышает его питательную ценность по сравнению с аналогичными маслами семян. Преобладающими полиненасыщенными жирами омега-3 и омега-6, содержащимися в масле семян конопли, являются линолевая кислота и α-линолевая кислота, которые обладают сильной антиоксидантной активностью и действуют как стимулятор иммунитета. Учитывая огромное количество, в котором они существуют, такие композиции являются наиболее желательными компонентами масла. Соотношение линолевой кислоты к α-линолевой кислоте 3:1 считается оптимальным для применения9,10. Оно обладает антитромботическими, противораковыми и противовоспалительными свойствами, которые входят в число нескольких преимуществ, приписываемых омега-3 жирным кислотам. Кроме того, пищевые кислоты омега-3 повышают общую скорость метаболизма и способствуют потере жира10,11.

 

Хотя несколько исследований в основном сосредоточены на важных питательных веществах жирнокислотного состава масла семян конопли, конопляное масло содержит дополнительные элементы, которые также оказывают терапевтическое действие. Такие соединения, как метилсалицилат и ситостерин, улучшают питательную ценность масла семян конопли, одновременно повышая его полезность в качестве пищевой добавки. Несмотря на то, что представленная информация о масле семян конопли только подтверждает его питательный профиль, эти дополнительные компоненты привели к значительному улучшению и должны быть дополнительно изучены на предмет других благоприятных эффектов12.

Растущая устойчивость грибов к обычным противогрибковым препаратам вызвала интерес к натуральным альтернативам, таким как масло семян конопли. Различные исследователи сообщали о противогрибковых свойствах эфирных масел семян конопли в отношении различных штаммов дрожжеподобных грибов, что указывает на их потенциал в борьбе с грибковыми инфекциями13,14.

 

За последнее десятилетие наномицеллы привлекли значительный интерес к диагностике и терапии многочисленных заболеваний, что привело к получению разрешения FDA15. Обычно их создают с использованием амфифильных полимеров, собранных в воде, с гидрофильной оболочкой и гидрофобной сердцевинной структурой из наномолекул. Наличие липофильного центра повышает растворимость в воде и позволяет регулировать высвобождение лекарства16. Гидрофильная оболочка защищает препарат от воздействия окружающей среды и не допускает его контакта с компонентами плазмы. Это позволяет препарату длительное время циркулировать в организме. Кроме того, малый размер частиц позволяет им дольше оставаться в крови17. Это верно для обхода печени, фильтрации через селезенку, клубочкового клиренса, лучшего клеточного всасывания и создания пропускных барьеров в эпителиальной мембране. Эти факторы способствуют повышению биодоступности препарата17,18.

 

Основной целью этого исследования было разработать новый терапевтический подход к борьбе с МФИ путем разработки и характеристики наномицеллез, содержащих позаконазол и масло семян конопли, для перорального применения. В частности, для получения мицелл использовался метод наноосаждения с последующей оптимизацией с использованием конструкции Box Behnken для достижения четко определенных физико-химических свойств. Определение характеристик с использованием таких методов, как просвечивающая электронная микроскопия и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM). В ходе исследования также были обнаружены отличающиеся кинетика высвобождения препарата in vitro и противогрибковая активность наномицеллез по сравнению с обычными суспензионными составами. Кроме того, целью исследования была оценка фармакокинетического профиля разработанных наномицелл, особое внимание уделяя их относительной биодоступности и периоду полувыведения по сравнению с контрольной суспензией.

 

Материалы

Экстрагированное масло семян конопли было закуплено в Кумаокханде, штат Айх, штат Химачал-Прадеш, Индия, а позаконазол (форма-I) был приобретен в MSN Labratories Private Limited, Телангана, Индия. Транскутол HP и Прецирол ATO 5 были приобретены в Gattefosse. Твин 80, дистиллированная вода и полоксамер 188 были получены в CDH Fine Chemicals, Нью-Дели, Индия.

 

Получение наномицеллезов позаконазола и масла семян конопли

Получение наномицелл было достигнуто методом нанопреципитации. Для первоначального приготовления использовали 1% мас./об. раствор PLGA (50:50). Для определения идеальной концентрации неионного поверхностно-активного вещества полоксамера 188 была проведена серия тестов. В частности, 5 мл 1% раствора PLGA постепенно вводили в четыре различных раствора на водной основе, каждый из которых содержал различные концентрации полоксамера 188, то есть 2,5, 3, 4 и 10 мг/мл. Смеси перемешивали, чтобы облегчить процесс. Как только была установлена наиболее эффективная концентрация поверхностно-активного вещества, следующим шагом было регулирование соотношений PLGA к позаконазолу и маслу семян конопли. Были приготовлены три отдельных раствора по 5 мл, содержащих 1% мас. % PLGA в ацетоне, с концентрациями позаконазола и масла семян конопли, скорректированными для достижения соотношения массы к массе (мас.%) PLGA: позаконазола и масла семян конопли в соотношениях 5:1, 10:1 и 15:1. Затем эти органические растворы методично добавляли при стабильной скорости потока 0,3 мл/мин в водную среду, насыщенную оптимальной концентрацией полоксамера 188. Почти сразу смесь стала мутной, что свидетельствует о самопроизвольном образовании систем наночастиц в результате вытеснения растворителя и осаждения полимера.

 

Кроме того, ацетон удаляли из системы через роторный испаритель методом вакуумного выпаривания при 60°C в течение 6 часов. После повторного диспергирования слоя, образовавшегося в результате вокруг RBF, было получено примерно 30 мл препарата. Наномицеллы трижды фильтровали через нейлоновый фильтр 0,22 мкм с последующим вращением при 10000 оборотах в минуту в течение 10 мин при 4°C с использованием охлаждающей центрифуги (Remi, Индия) для отделения свободного лекарственного средства от наномицелл с добавлением лекарственного средства19,20.

 

Оптимизация концентрации полимеров путем определения критической концентрации мицелл (CMC)

CMC наномицеллез определяли с использованием йода в качестве гидрофобного зонда. В этом эксперименте стандартный раствор йода/йодида калия (I2/KI) готовили путем смешивания йода и йодида калия в соотношении 1:2 в 50 мл дистиллированной деионизированной воды. Различные концентрации раствора PLGA: полоксамер 188 (4:1) в диапазоне от 1 до 40 мкг/мл были приготовлены в дистиллированной деионизированной воде. К этим различным разведениям растворов полимеров добавляли 25 мкл раствора I2/KI и инкубировали смесь в темноте при комнатной температуре в течение 24 ч. В течение периода инкубации гидрофобный йод отделялся от раствора KI3 и мигрировал в гидрофобное ядро наномицеллез. Это привело к изменению оптической плотности с 460 до 366 нм. Таким образом, после инкубационного периода измеряли и регистрировали поглощение УФ-излучения различных разведенных концентраций при 366 нм21,22.

 

Оптимизация наномицеллезов

Дизайн Box Behnken использовался в версии Design Expert 11.0 для исследования влияния трех независимых переменных, а именно: PLGA, поверхностно-активного вещества и времени перемешивания на размер частиц, PDI и % эффективности улавливания, как показано в таблице 1. Другие факторы, такие как скорость перемешивания и температура, оставались постоянными. Влияние этих факторов изучалось при составлении рецептур с использованием различных типов комбинаций. Программное обеспечение сгенерировало полиномиальные уравнения для моделирования этих взаимосвязей, а также графики реакции, отображающие поверхности, которые помогли проанализировать влияние различных факторов на реакцию, учитывая как линейные, так и квадратичные эффекты. Квадратичные модели подчеркивали наиболее значимые комбинированные эффекты и индивидуальные эффекты этих факторов. Анализ основывался на экспериментальных прогонах, где наблюдались различные уровни этих факторов в определенном диапазоне. Для подтверждения результатов были проведены дополнительные эксперименты с использованием прогнозируемых оптимальных уровней факторов. Сравнивая результаты этих тестов с ожидаемыми значениями, мы убедились, что результаты эксперимента полностью соответствовали прогнозам. Этот процесс валидации позволил подтвердить надежность оптимизированной композиции и вселил уверенность в ее эффективности, поскольку продемонстрировал тесное соответствие между наблюдаемыми значениями реакции и ожидаемыми результатами

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение, в этом исследовании были успешно разработаны и охарактеризованы наномицеллы для приема внутрь позаконазола и масла семян конопли для потенциального противогрибкового лечения. Эти результаты свидетельствуют о стабильной и однородной рецептуре. Детальная характеристика выявила ключевые тепловые характеристики компонентов, такие как эндотермические пики, связанные с позаконазолом, маслом семян конопли, PLGA и полоксамером. 

 

Был проведен анализ молекулярного докинга, чтобы исследовать, как различные лиганды взаимодействуют с кристаллической структурой. Также были идентифицированы пики поглощения, соответствующие конкретным функциональным группам, что улучшило наше понимание молекулярных взаимодействий в составе. Кроме того, наномицеллы демонстрировали благоприятную кинетику высвобождения лекарственного средства, при этом мицеллы с добавлением позаконазола достигали более высокого кумулятивного высвобождения по сравнению с контрольной суспензией через 24 ч.

 

Примечательно, что противогрибковые исследования против Aspergillus niger и Candida albicans продемонстрировали многообещающие ингибирующие эффекты, подтверждая потенциальную терапевтическую значимость разработанных наномицеллез. Эти результаты в совокупности подчеркивают целесообразность и эффективность перорального применения наномицеллезов позаконазола и масла семян конопли для лечения грибковых заболеваний. Успешная формулировка, характеристика и положительные результаты исследований in vitro обеспечивают основу для потенциальных будущих исследований и клинического применения.

 

 Четкие данные CLSM-визуализации подчеркивают решающую роль характеристик мицелл в облегчении их проникновения в более глубокие слои. Используя синергические свойства позаконазола и масла семян конопли в наномицеллах, это исследование способствует разработке новых подходов к противогрибковой терапии. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить стабильность масла семян конопли после приготовления, поскольку в нем высокое содержание ненасыщенных жирных кислот, которые очень чувствительны к окислению.