Разнообразие микробиома и вариации генотипов промышленной конопли

Вакар Ахмад, Лорин Коффман, Рам Л. Рэй, Венкатеш Балан, Аруна Вирасурия, Абдул Латиф Хан

Microbiome diversity and variations in industrial hemp genotypes (Разнообразие микробиома и вариации генотипов промышленной конопли). Scientific Reportsvolume 14, Article number: 29560 (2024)

 https://doi.org/10.1038/s41598-024-79192-7

АННОТАЦИЯ

Микроорганизмы, такие как бактерии и грибы, играют важнейшую роль в росте и развитии растений-хозяев. Однако факторы окружающей среды и генотипы растений-хозяев могут влиять на состав и разнообразие микробиома таких растений, как промышленная конопля (Cannabis sativa L.). В этой статье мы оценили эндофитные и ризосферные микробные сообщества двух сортов конопли с высоким содержанием каннабидиола (КБД; Sweet Sensi и Cherry Wine) и двух сортов с низким содержанием КБД (American Victory и Unknown). 

Четыре сорта конопли показали значительные различия в разнообразии микробиома. В корнях было значительно больше грибковых и бактериальных эндофитов, чем в стеблях, в то время как в стеблях было больше грибковых эндофитов, чем бактериальных. Интересно, что в почвенной системе не было значительных различий в разнообразии между генотипами с высоким содержанием КБД и генотипами с высоким содержанием клетчатки. В филах грибов Ascomycota и Basidiomycota у генотипов с высоким содержанием КБД было значительно больше в корнях и стеблях, чем в листьях, по сравнению с генотипами с высоким содержанием клетчатки. 

Наиболее распространёнными филами бактерий были Proteobacteria, Acidobacteria и Actinobacteria. Мы обнаружили 16 и 11 основных видов бактерий и грибов в микробиоме разных генотипов. Sphingomonas, Pseudomonas и Bacillus были основными бактериями генотипов волокна с высокой численностью по сравнению с генотипами СВД. Напротив,  Microbacterium и Rhizobium были значительно более распространены в CBD, чем в волокне. Alternaria и Gibberella  формировали основной грибковый микробиом генотипа волокна, а не CBD. Напротив, Penicillium и Nigrospora были значительно более распространены в CBD, чем в генотипах волокна. 

В заключение отметим, что определённые генотипы конопли привлекают специализированные микробные сообщества в ризосферу и филлосферу. Использование основных видов микробиома может помочь поддерживать и улучшать рост конопли, а также целенаправленно воздействовать на специализированные характеристики генотипа.

ВЫДЕРЖКИ:

Введение

Промышленная конопля и марихуана относятся к одному биологическому виду Cannabis sativa L., но различаются по назначению, выращиванию и химическому составу1,2. Тождество двух разных генотипов в основном определяется порогом содержания психоактивного соединения дельта-9-тетрагидроканнабинола (ТГК) и каннабидиола (КБД)3,4,5. Недавно в США были смягчены ограничения на производство современной промышленной конопли с содержанием ТГК менее 0,3%, что привело к возобновлению интереса к выращиванию конопли 6,7. Конопля занимает значительную долю рынка в Северной Америке, в основном в качестве сырья для производства волокна, масла и фармацевтических препаратов7. Селекция и методы выращивания также сыграли важную роль в разнообразии генотипов конопли8. 

Промышленная конопля была выведена селекционным путём для получения желаемых характеристик, таких как качество волокна, урожайность семян, содержание масла и психоактивные свойства, что привело к появлению различных фенотипов и хемотипов9,10,11,12. Несмотря на технологические достижения в селекции конопли, соотношение (КБД) и ТГК сильно варьируется в зависимости от пола (мужской или женский), генотипа, методов выращивания, а также биотических и абиотических факторов. Совсем недавно было показано, что микроорганизмы, такие как грибы или бактерии, играют важную роль в определении фенотипа и хемотипа13. Определённые генотипы могут содержать определённые микроорганизмы в филлосфере и ризосфере14.

Микроорганизмы, живущие на растениях-хозяевах в качестве эндофитов (внутри) или эпифитов (снаружи), обеспечивают доступ к необходимым питательным веществам, вырабатывают полезные метаболиты и ферменты и защищают растения от биотических и абиотических факторов стресса14,15. Микробные сообщества, связанные с растениями-хозяевами, могут выполнять определённые функции, и их разнообразие может зависеть от (i) генетического состава растения-хозяина, (ii) физиолого-фотосинтетических реакций на окружающую среду, (iii) среды обитания, (iv) воздействия стресса и реакций на него14,15,16. Кроме того, виды, относящиеся к полезному и основному микробиому (таксономии микроорганизмов, в изобилии присутствующих в определённой среде обитания17), демонстрируют значительные различия в зависимости от типа почвы, ризосферы (подземной части растения) и филлосферы (надземной части растения)18. 

Различия в микробиоме можно определить как изменения в разнообразии конкретных родов в разных частях и сегментах растения-хозяина14. Эти различия существенно влияют на несколько функций микробов на разных стадиях роста растения-хозяина14,19. Таким образом, важно понимать эти различия, чтобы улучшить рост растения-хозяина для получения определённых экономически важных характеристик, например, КБД и клетчатки в конопле. Несколько недавних исследований показали, что генотипы растений-хозяев могут влиять на определённые фенотипические характеристики, в том числе на выработку специализированных метаболитов и симбиоз с определёнными микробами. Например, тис ягодный вырабатывает паклитаксел, а симбиотическая Pestalotiopsis microspore Ne32 переняла эту особенность. Кроме того, эти же виды улучшают рост растений20. Аналогичный вывод был сделан в отношении разнообразия основных микробиомов, когда C. sativa «TJ’s CBD» использовалась в шести полевых условиях5.

Наша первоначальная работа включала в себя выращивание более 100 образцов, полученных из разных регионов США. После тщательной оценки мы определили и выбрали сорта, которые продемонстрировали оптимальную производительность в уникальных климатических условиях Техаса21. Мы сосредоточились на наиболее эффективных сортах с точки зрения КБД (Sweet Sensi и Cherry Wine) и клетчатки (American Victory и неизвестный сорт). Неизвестный сорт, использованный в этом исследовании, всё ещё находится на стадии селекции и испытаний. 

Сорта конопли в настоящее время нуждаются в стандартизированной ботанической номенклатуре. Отрасль по-прежнему использует различные ненаучные общепринятые названия. В этом контексте термин «неизвестный сорт/генотип» означает, что мы даже не знаем общепринятого названия этого генотипа. Мы использовали эти сорта в качестве отправной точки для всесторонних испытаний на уровне полей. Наше исследование выходило за рамки традиционной оценки урожайности и качества и было направлено на изучение сложного разнообразия микробиома, связанного с этими сортами/генотипами.

В ходе этого исследования мы стремились выявить интригующую взаимосвязь между сортами конопли и их микробиотой, тем самым внеся ценный вклад в более широкое понимание устойчивых и жизнеспособных методов выращивания промышленной конопли в Техасе (США). Однако до сих пор не до конца понятно, как различные сорта конопли привлекают и заселяют микробные сообщества. Таким образом, в этом исследовании мы оценили (i) структуру микробиома и разнообразие двух генотипов конопли, производящих КБД (Sweet Sensi и Cherry Wine), и двух генотипов, производящих волокна (American Victory и неизвестный сорт), и (ii) оценили основную структуру микробиома в ризосфере (почва и корни) и филлосфере (стебель и листья). Неизвестный сорт находится в процессе описания и таксономической классификации. Мы объясним два важных фактора, которые могут влиять на состав микробиома, а именно: (i) генотипы, то есть сорта конопли, ориентированные на КБД или волокна, и (ii) разнообразие микробиома ризосферы и филлосферы. Мы демонстрируем, что эти факторы могут влиять на разнообразие микробиома с помощью секвенирования и анализа нового поколения. Результаты этого исследования помогут понять, как функционирует микробиом растений конопли, что может способствовать разработке инокулятов, стимулирующих рост растений, для коммерческого выращивания важных сортов конопли.

Материалы и методы

Растительный материал и условия произрастания

В полевых условиях были выращены сорта «Свит Сенси», «Черри Вайн», «Американская Победа-1» и один неизвестный генотип технической конопли. На стадии зрелости образцы были собраны на поле Университета Прери-Вью (PVAMU; широта: 30,0919, долгота: − 95,9894). Изначально компания Tetra Hemp (Техас, США) предоставила сорт «Свит Сенси» (рис. 1A), «Черри Вайн» (рис. 1B) и «Неизвестные зародыши» (рис. 1D). Зародыши «Американской победы» (рис. 1C) были предоставлены компанией Aqui Flow LLC, штат Техас, для PVAMU. PVAMU имеет лицензию штата Техас на выращивание и исследования конопли, и все растения выращивались в соответствии с рекомендациями и законодательством. Все образцы были собраны с 9 разных растений и из почвы в их ризосфере. 

Образцы растений и почвы были собраны в филлосфере (листья и стебли) и ризосфере (корни и почва) и доставлены в лабораторию в стерильных условиях при температуре 4 °C. Извлечение ДНК проводилось из 3 повторных образцов каждого вида (листья, стебля, корня и почвы). Образцы почвы были собраны в ризосферных зонах (рядом с корнями, на глубине около 15 см) и просеяны через сито (2–4 мм) для выделения ДНК. Корни, стебли и листья были простерилизованы для удаления эпифитных микроорганизмов. Для стерилизации поверхности образцы промыли гипохлоритом натрия (5%), этанолом (70%) и автоклавированной дистиллированной водой22. После подготовки образцов все четыре генотипа были немедленно помещены в жидкий азот и хранились при температуре −80 °C до дальнейшего анализа.

Ризосферный и филлосферный микробиом конопли

В почве наиболее распространёнными (относительная численность ≥ 1%) типами бактерий были Firmicutes, Proteobacteria, Myxococcota, Actinobacteriota, Bacteroidota, Plantomycetota, Acidobacteriota и Chloroflexi. Из восьми типов бактерий, представленных в данных, три наиболее распространённых типа были Proteobacteria, Acidobacteria и Actinobacteria. За исключением корневой системы, Firmicutes значительно преобладают по сравнению с образцами почвы. Proteobacteria и Actinobacteria по-прежнему широко распространены в корневой системе. Наиболее распространёнными родами (относительная численность ≥ 1%) являются Streptomyces, Bacillus и Pseudomonas во всех генотипах. Среди ключевых родов, характерных для американской формации «Победа-1», были представители семейства Kineosporiceae, которые составляют примерно 15% от общего числа видов, и род Xylella, представленный 16% от общего числа видов 

Результаты показали, что в генотипах, богатых КБД, значительно больше представителей фил Ascomycota, Basidiomycota и основных родов микробиома Alternaria, Penicillium и Gibberella, чем в генотипах, богатых клетчаткой. Аналогичным образом, концентрическими филами протеобактерий, ацидобактерий, актинобактерий и основными бактериальными родами были Sphingomonas, Pseudomonas и Bacillus. Это говорит о том, что определённые генотипы привлекают специализированные микробные сообщества из разных сфер взаимодействия. Наши результаты подчёркивают различия в местном микробиоме в зависимости от почвенной среды и генотипа растения

-------

Публичный скрипт и связанные с ним файлы этого исследования можно найти на GitHub (https://github.com/Plant-Microbiome-and-Genomics-Lab/Hemp-Genotype-variation-in-the-microbiome).